Для получения тонких (до 6 мкм) гистологических срезов необходимо фиксированный и промытый материал залить в плотную среду, предварительно пропитав ею кусочки тканей. В зависимости от способа растворения все заливочные среды разделяются на растворимые в органических растворителях и водорастворимые. К первым относятся парафин, пластические полимеры на основе парафина, целлоидин, ко вторым – желатин, полиэтиленгликоли, полиэфиры, некоторые метакрилаты.
Парафин – смесь высокомолекулярных предельных углеводородов, продукт перегонки нефти; растворяется в анилине, бензоле, бергамотном масле, целлозольве, хлороформе, декалине, диоксане, бутаноле, пропаноле, толуоле, трихлориэтилене, ксилоле. Каждый из этих растворителей можно использовать в качестве промежуточной среды между спиртом и парафином.
Температура плавления различных парафинов находится в диапазоне от 27 до 62?С. В гистологической технике применяют парафин с температурой плавления 56?С.
Ряд зарубежных фирм производят специальный парафин для гистологических исследований, содержащий различные пластические полимеры, такие как диметилсульфоксид («Парапласт», «Гистопласт С», «Гистозес»). Отдельно следует выделить новую гомогенизированную парафиновую среду для заливки Histomix®, содержащую в своем составе натуральный воск и синтетические полимерные добавки.
С точки зрения гистологической техники условия затвердевания парафина при заливке объекта весьма важны. Когда расплавленный парафин начинает затвердевать, на его поверхности возникает пленка в виде хлопьевидного облака, а затем начинают образовываться кристаллы, из которых состоит твердый парафин. Это изменение состояния парафина влечет за собой уменьшение его объема приблизительно на 5-10%, что обусловливает константные деформации заделанной в парафин ткани. Кристаллы парафина имеют форму пластинок или игл более или менее тонких, в зависимости от охлаждения. Чем охлаждение медленнее, тем тоньше кристаллы. Следует отметить, что кристаллы, выпадающие в тканевых пространствах при заключении объекта в парафин, не оказывают деформирующего влияния по причине своих небольших размеров. Когда парафин начинает затвердевать – он непрозрачен, затем становится прозрачным, с блестящей поверхностью. В этот момент сжатие парафина прекращается.
Весьма важную роль в затвердевании парафина играет растворенный в нем воздух. При охлаждении определенного объема парафина сперва затвердевает его поверхностный слой. Поскольку растворимость воздуха в застывающем парафине снижена, в месте соприкосновения жидкого парафина и затвердевающего слоя выделяется воздух. Часть этого воздуха растворяется в более теплой и еще жидкой центральной массе, а другая часть остается в газообразном состоянии между кристаллами парафина. Таким образом могут создаваться полости, заполненные воздухом. Это обусловливает зернистый вид в центре блока после его затвердевания. Чтобы избежать подобной грануляции парафина в ходе заделки объекта, можно применять различные средства. Небольшие кусочки ткани (2-3 мм) можно заделывать на часовом стекле в малом количестве парафина, который медленно наливают пипеткой. При более крупных объектах хорошие результаты дает заливка в глубоком и узком сосуде; при этом затвердевание парафина начинается в глубине и распространяется кверху, а освобождающийся воздух выделяется на поверхности.
Для заливки в парафин объект необходимо сперва обезводить, затем провести через промежуточную среду, растворимую как в парафине, так и в спирте.
Таким образом, в процессе заливки объекта в парафин выделяют четыре основных этапа:
- обезвоживание спиртом,
- пропитывание промежуточной средой (ксилол, толуол, бензол и др.),
- пропитывание парафином,
- окончательное заключение в парафин.
Целлоидин – хорошо растворяющаяся в эфире нитроклетчатка. В гистологической практике применяют 2%, 4% и 8% растворы целлоидина, которые готовят из целлоидиновых пластин или отмытой от эмульсии и высушенной рентгеновской пленки.
Заливка ткани в целлоидин в настоящее время менее популярна, чем парафиновая, и ее применяют главным образом для заливки труднорежущихся тканей и объектов больших размеров, с которых трудно получить хорошие парафиновые срезы. Целлоидиновую заливку используют также в тех случаях, когда необходимо избежать воздействия на исследуемый материал высоких температур. Кроме того, заливка материала в целлоидин позволяет получить лучшие результаты при наличии в объектах больших полостей, лакун и слоев различной консистенции.
Эфир и сухой целлоидин огнеопасны, поэтому при работе с ними следует соблюдать осторожность.
Заливка в целлоидин-парафин рекомендуется для обработки объектов, которые легко сжимаются при парафиновой заливке, например органов кроветворения, мезенхимной ткани, а также органов и тканей, имеющих многослойное строение (трахея, кожа и др.). При этом используются выгодные стороны обоих методов.
Заливка в желатин находит широкое применение при изучении объектов, легко распадающихся при резке на крио-микротоме, при изготовлении срезов с органов, богатых соединительной тканью, изучении эмбриональных объектов, а также жировых и липоидных включений. Используют кристаллический прозрачный пищевой желатин, из которого готовят 25% и 12.5% растворы.
Заливка в водораствормые пластмассы хорошо зарекомендовала себя в гистохимии, особенно для выявления липидов и ферментов. Используются синтетические пластмассы – полиэтиленгликоль, поливакс, метилметакрилат и др. |
